Imagerie cellulaire en santé

Compétences techniques

Préparation histologique et cytologique d’échantillons biologiques divers (organismes entier animal ou végétal, organes, tissus ou cellules), avec observations et analyses des préparations :

• Service d’histologie et cytologie,
• Service de microscopie électronique,
• Service de microscopie optique et analyse d’images.

Domaines d'application

Cancérologie, neurosciences, relations hôtes-greffons, microbiologie, virologie, agro-alimentaire

Analyses et équipements

Préparation des échantillons à analyser par histologie et cytologie

• Préparation des échantillons pour une observation en microscopie optique. Utilisation de différentes méthodes : coupes, colorations, immuno-marquages et marquages in-vivo, ex-vivo.
  • Stations déshydratation - Leica ASP300S
  • Station d’enrobage - Leica EG1160
  • Automate à colorations – Leica Autostainer XL
  • Automate à immuno-marquages – Leica BondMax
  • Cryostat – Leica CM3050S
  • Microtomes – Leica RM2145, Jung RM2045, Leica HistoCore
  • Vibratome – Leica VT1200S
  • Station de micro injection – Zeiss Eppendorf
• Préparation des échantillons pour une observation en microscopie électronique ou optique. Utilisation de différentes méthodes : inclusions, coupes, immuno-marquages, marqueurs d’activités enzymatiques, coloration négative, contraste, coloration Bleu de Toluidine.
  • Automate d’inclusion – Leica EMAMW
  • Ultramicrotome - Reichert Ultracut E

Observations des échantillons et acquisitions d’images à différentes échelles

• Observation macroscopique sur échantillons entiers (organismes, organes, roches et minéraux, coupes de tissus) ou épais, par lumière blanche directe ou techniques de fluorescence (DAPI, FITC, Rhodamine).
  • Axio Zoom, Zeiss
• Observation microscopique de préparations sur lames par lumière blanche
  • Axio Scope A1, Zeiss
• Observation microscopique de préparations sur lames en fluorescence (BS640, DAPI, FITC, Rhodamine, AF680, BS757).
  • Axio Imager, Zeiss
• Vidéomicroscopie en plaques et observation microscopique sur lames sur microscope optique inversé par lumière blanche ou fluorescence (DAPI, FITC, Rhodamine).
  • Station de vidéomicroscopie : Cell Observer, Zeiss
• Observation microscopique à l’échelle du nanomètre sur microscope électronique en transmission ou à balayage.

Analyses des résultats 

• Amélioration des images (correction d’illumination, filtrage, …)
• Analyse type Wound Healing, suivi de cellules (vitesse, distance, tortuosité, …), chimiotactisme, …
• Analyse spécifique d’objets (création d’algorithmes pour détection des nœuds, longueur d’objets, nombre d’objets, surface d’objets, intensité, …)
• Analyse statistique (statistique descriptive, tests non paramétriques, …)

Exemples de réalisations

Demandes pour des laboratoires publiques de recherche :

• Demande Type : 3 colorations histologiques + 1 à 3 immunomarquages + lames blanches sur 2-5 organes par animal pour 20 à 100 animaux.
  • Travaux réalisés : Inclusion des échantillons en paraffine ; Coupes fines sur microtome ; Colorations histologiques telles que Hématoxyline-Eosine, Trichrome de Masson, Rouge Sirius. Mise au point sur échantillon contrôle puis réalisation de d’immunomarquages simples (tels que anti-Ki67, anti-Caspase-3). Acquisition d’images sur microscopes en lumière blanche, polarisée ou en fluorescence. Conception de l’algorithme pour une analyse d’images automatisée. Réalisation de l’analyse d’images : images et tableau des résultats transmis.
• Demande de mise au point et réalisation de 3 triples marquages + 3 doubles marquages en fluorescence sur tumeurs.
  • Travaux réalisés : Inclusion en milieu d’enrobage pour congélation ; Coupes fines sur cryostat ; Mise au point des immunomarquages en triples marquages sur échantillons témoins. Réalisation des triples immunomarquages révélés en fluorescence sur tumeurs. Observation et prise d’images sur microscope optique à fluorescence. Conception de l’algorithme pour l’analyse d’images puis analyse d’images. Ce projet nous a permis d’atteindre la réalisation concrète des triples marquages et de définir un type d’analyse d’images associé.
• Demande de quintuples immunomarquages par révélation en lumière blanche en séquentiel sur 5 biopsies de carotides humaines.
  • Travaux réalisés : Inclusion des échantillons en paraffine ; Coupes fines sur microtome ; Mise au point des immunomarquages individuels par révélation en lumière blanche sur échantillons contrôle. Après chaque immunomarquage, une acquisition d’image de la zone d’intérêt est réalisée sur microscope optique, puis réalisation de l’immunomarquage suivant après élimination du précédent. L’analyse d’images permet de reconstituer une seule image à partir des 5 images obtenues par superposition afin d’apporter la précision de la localisation de chaque marqueur.
•  Demande de vidéomicroscopie sur culture de cellules pour test de Wound Healing.
  • Travaux réalisés : préparation des conditions environnementales et paramétrage de la plaque de cellules sur le vidéomicroscope pour une acquisition d’images en séquentiel sur 72h, à raison de 3 points âr puits et une acquisition d’images toutes les 30 minutes.
• Demande d’observation en fluorescence sur le macroscope pour sélectionner les graines d’Arabidopsis mutantes après traitement génétique.
• Demande de coloration spécifique sur jeunes racines de pois fourrager.
  • Mise en œuvre spécifique du protocole pour des échantillons végétaux : choix du fixateur, de l’inclusion la plus adaptée, développement d’une coloration pour végétaux, mise au point de la coloration spécifique Safranine-Bleu Astra.

Demande pour une société privée :

• Demande d'observation en microscopie électronique de constituants cellulaires présents dans les cellules de foies et de peaux de souris.
  • Travaux réalisés : mise au point pour optimisation du protocole : choix du fixateur, de la résine d’enrobage la plus adaptée, développement d’une technique normalement utilisée en microscopie électronique pour une observation en microscopie optique afin d’apporter une finesse d’analyse d’images que l’histologie ne pouvait pas atteindre. Notre offre de service spécifique : fixation, inclusion en résine Epon, coupes semi-fines avec coloration au Bleu de Toluidine suivie de l’acquisition d’images en microscopie optique pour les échantillons de foies, et coupes ultra-fines avec contraste sur grilles suivies de l’acquisition d’images sur microscope électronique pour les autres organes.